La chromatographie liquide est la principale méthode pour tester le contenu de chaque composant et les impuretés dans les matières premières, les intermédiaires, les préparations et les matériaux d'emballage, mais de nombreuses substances ne disposent pas de méthodes standard sur lesquelles s'appuyer, il est donc inévitable de développer de nouvelles méthodes. Dans le développement de méthodes en phase liquide, la colonne chromatographique est au cœur de la chromatographie liquide. Il est donc crucial de choisir une colonne chromatographique appropriée. Dans cet article, l'auteur expliquera comment choisir une colonne de chromatographie liquide sous trois aspects : idées générales, considérations et champ d'application.
A.Idées générales pour la sélection des colonnes de chromatographie liquide
1. Évaluer les propriétés physiques et chimiques de l'analyte : telles que la structure chimique, la solubilité, la stabilité (par exemple s'il est facile d'être oxydé/réduit/hydrolysé), l'acidité et l'alcalinité, etc., en particulier la structure chimique est la clé facteur déterminant les propriétés, tel que le groupe conjugué a une forte absorption ultraviolette et une forte fluorescence ;
2. Déterminer le but de l'analyse : si une séparation élevée, une efficacité de colonne élevée, un temps d'analyse court, une sensibilité élevée, une résistance à haute pression, une longue durée de vie de la colonne, un faible coût, etc. sont nécessaires ;
- Choisissez une colonne chromatographique adaptée : comprenez la composition, les propriétés physiques et chimiques de la charge chromatographique, telles que la taille des particules, la taille des pores, la tolérance à la température, la tolérance au pH, l'adsorption de l'analyte, etc.
- Considérations pour la sélection des colonnes de chromatographie liquide
Ce chapitre abordera les facteurs à prendre en compte lors de la sélection d'une colonne de chromatographie du point de vue des propriétés physiques et chimiques de la colonne de chromatographie elle-même. 2.1 Matrice de remplissage
2.1.1 Matrice de gel de silice La matrice de remplissage de la plupart des colonnes de chromatographie liquide est le gel de silice. Ce type de charge a une pureté élevée, un faible coût, une résistance mécanique élevée et des groupes faciles à modifier (tels que la liaison phényle, la liaison amino, la liaison cyano, etc.), mais la valeur du pH et la plage de température qu'elle tolère sont limitées : La plage de pH de la plupart des charges matricielles de gel de silice est de 2 à 8, mais la plage de pH des phases liées au gel de silice spécialement modifiées peut être aussi large que 1,5 à 10, et il existe également des phases liées au gel de silice spécialement modifiées qui sont stables à faible pH. comme Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, qui est stable à pH 1 à 8 ; la limite supérieure de température de la matrice de gel de silice est généralement de 60 ℃, et certaines colonnes de chromatographie peuvent tolérer une température de 40 ℃ à un pH élevé.
2.1.2 Matrice polymère Les charges polymères sont principalement du polystyrène-divinylbenzène ou du polyméthacrylate. Leurs avantages sont qu’ils peuvent tolérer une large plage de pH – ils peuvent être utilisés dans une plage de 1 à 14 et ils sont plus résistants aux températures élevées (peut atteindre plus de 80 °C). Comparé aux charges C18 à base de silice, ce type de charge a une hydrophobie plus forte et le polymère macroporeux est très efficace pour séparer des échantillons tels que des protéines. Ses inconvénients sont que le rendement de la colonne est moindre et la résistance mécanique est plus faible que celle des charges à base de silice. 2.2 Forme des particules
La plupart des charges HPLC modernes sont des particules sphériques, mais parfois des particules irrégulières. Les particules sphériques peuvent fournir une pression de colonne plus faible, une efficacité de colonne plus élevée, une stabilité et une durée de vie plus longue ; lors de l'utilisation de phases mobiles à haute viscosité (telles que l'acide phosphorique) ou lorsque la solution échantillon est visqueuse, les particules irrégulières ont une surface spécifique plus grande, ce qui est plus propice à la pleine action des deux phases, et le prix est relativement bas. 2.3 Taille des particules
Plus la taille des particules est petite, plus l'efficacité de la colonne et la séparation sont élevées, mais plus la résistance à haute pression est mauvaise. La colonne la plus couramment utilisée est la colonne de granulométrie de 5 µm ; si les exigences de séparation sont élevées, une charge de 1,5 à 3 µm peut être sélectionnée, ce qui permet de résoudre le problème de séparation de certaines matrices complexes et d'échantillons multi-composants. UPLC peut utiliser des charges de 1,5 μm ; Des charges de granulométrie de 10 μm ou plus sont souvent utilisées pour les colonnes semi-préparatives ou préparatives. 2.4 Teneur en carbone
La teneur en carbone fait référence à la proportion de phase liée à la surface du gel de silice, qui est liée à la surface spécifique et à la couverture de la phase liée. La teneur élevée en carbone offre une capacité de colonne élevée et une haute résolution, et est souvent utilisée pour des échantillons complexes nécessitant une séparation élevée, mais en raison du long temps d'interaction entre les deux phases, le temps d'analyse est long ; les colonnes chromatographiques à faible teneur en carbone ont un temps d'analyse plus court et peuvent montrer différentes sélectivités, et sont souvent utilisées pour des échantillons simples qui nécessitent une analyse rapide et des échantillons qui nécessitent des conditions de phase aqueuse élevées. Généralement, la teneur en carbone du C18 varie de 7 % à 19 %. 2.5 Taille des pores et surface spécifique
Les supports d'adsorption HPLC sont des particules poreuses et la plupart des interactions ont lieu dans les pores. Les molécules doivent donc pénétrer dans les pores pour être adsorbées et séparées.
Taille des pores et surface spécifique sont deux notions complémentaires. Une petite taille de pores signifie une grande surface spécifique, et vice versa. Une grande surface spécifique peut augmenter l'interaction entre les molécules de l'échantillon et les phases liées, améliorer la rétention, augmenter le chargement de l'échantillon et la capacité de la colonne, ainsi que la séparation des composants complexes. Les charges entièrement poreuses appartiennent à ce type de charges. Pour ceux qui ont des exigences de séparation élevées, il est recommandé de choisir des charges avec une grande surface spécifique ; une petite surface spécifique peut réduire la contre-pression, améliorer l'efficacité de la colonne et réduire le temps d'équilibre, ce qui convient à l'analyse des gradients. Les charges noyau-coquille appartiennent à ce type de charges. Dans le but d'assurer la séparation, il est recommandé de choisir des charges avec une petite surface spécifique pour celles ayant des exigences élevées en matière d'efficacité d'analyse. 2.6 Volume poreux et résistance mécanique
Le volume des pores, également appelé « volume des pores », fait référence à la taille du volume vide par particule unitaire. Cela peut bien refléter la résistance mécanique de la charge. La résistance mécanique des charges à grand volume poreux est légèrement plus faible que celle des charges à petit volume poreux. Les charges avec un volume de pores inférieur ou égal à 1,5 mL/g sont principalement utilisées pour la séparation HPLC, tandis que les charges avec un volume de pores supérieur à 1,5 mL/g sont principalement utilisées pour la chromatographie d'exclusion moléculaire et la chromatographie basse pression. 2.7 Taux de plafonnement
Le coiffage peut réduire les pics de résidus provoqués par l'interaction entre les composés et les groupes silanol exposés (telles que les liaisons ioniques entre les composés alcalins et les groupes silanol, les forces de Van der Waals et les liaisons hydrogène entre les composés acides et les groupes silanol), améliorant ainsi l'efficacité de la colonne et la forme des pics. . Les phases liées non coiffées produiront des sélectivités différentes par rapport aux phases liées coiffées, en particulier pour les échantillons polaires.
- Champ d'application de différentes colonnes de chromatographie liquide
Ce chapitre décrira le champ d'application des différents types de colonnes de chromatographie liquide à travers quelques cas.
3.1 Colonne chromatographique C18 en phase inversée
La colonne C18 est la colonne à phase inversée la plus couramment utilisée, qui peut répondre aux tests de teneur et d'impuretés de la plupart des substances organiques, et est applicable aux substances moyennement polaires, faiblement polaires et non polaires. Le type et les spécifications de la colonne chromatographique C18 doivent être sélectionnés en fonction des exigences spécifiques de séparation. Par exemple, pour les substances ayant des exigences de séparation élevées, des spécifications de 5 μm*4,6 mm*250 mm sont souvent utilisées ; pour les substances avec des matrices de séparation complexes et une polarité similaire, des spécifications de 4 μm*4,6 mm*250 mm ou des tailles de particules plus petites peuvent être utilisées. Par exemple, l’auteur a utilisé une colonne de 3 μm*4,6 mm*250 mm pour détecter deux impuretés génotoxiques dans l’API du célécoxib. La séparation des deux substances peut atteindre 2,9, ce qui est excellent. De plus, dans le but d'assurer la séparation, si une analyse rapide est requise, une colonne courte de 10 mm ou 15 mm est souvent sélectionnée. Par exemple, lorsque l’auteur a utilisé LC-MS/MS pour détecter une impureté génotoxique dans l’API du phosphate de pipéraquine, une colonne de 3 μm*2,1 mm*100 mm a été utilisée. La séparation entre l'impureté et le composant principal était de 2,0, et la détection d'un échantillon peut être complétée en 5 minutes. 3.2 Colonne phényle en phase inversée
La colonne phényle est également un type de colonne à phase inversée. Ce type de colonne présente une forte sélectivité en composés aromatiques. Si la réponse des composés aromatiques mesurée par la colonne C18 ordinaire est faible, vous pouvez envisager de remplacer la colonne phényle. Par exemple, lorsque je préparais l'API du célécoxib, la réponse du composant principal mesurée par la colonne phényle du même fabricant et de même spécification (tous 5 μm*4,6 mm*250 mm) était environ 7 fois supérieure à celle de la colonne C18. 3.3 Colonne en phase normale
En complément efficace de la colonne à phase inversée, la colonne à phase normale convient aux composés hautement polaires. Si le pic est encore très rapide lors d'une élution avec plus de 90 % de phase aqueuse dans la colonne à phase inversée, et même proche et chevauchant le pic du solvant, vous pouvez envisager de remplacer la colonne à phase normale. Ce type de colonne comprend la colonne hilique, la colonne amino, la colonne cyano, etc.
3.3.1 Colonne hilique La colonne hilique intègre généralement des groupes hydrophiles dans la chaîne alkyle liée pour améliorer la réponse aux substances polaires. Ce type de colonne convient à l'analyse des substances sucrées. L'auteur a utilisé ce type de colonne pour faire le contenu et les substances associées du xylose et de ses dérivés. Les isomères d'un dérivé du xylose peuvent également être bien séparés ;
3.3.2 Colonne Amino et colonne Cyano La colonne Amino et la colonne Cyano font référence à l'introduction de modifications amino et cyano à l'extrémité de la chaîne alkyle liée, respectivement, pour améliorer la sélectivité pour les substances spéciales : par exemple, la colonne amino est un bon choix. pour la séparation des sucres, des acides aminés, des bases et des amides ; La colonne cyano a une meilleure sélectivité lors de la séparation de substances structurelles similaires hydrogénées et non hydrogénées en raison de la présence de liaisons conjuguées. La colonne Amino et la colonne Cyano peuvent souvent être commutées entre la colonne à phase normale et la colonne à phase inverse, mais une commutation fréquente n'est pas recommandée. 3.4 Colonne chirale
La colonne chirale, comme son nom l'indique, convient à la séparation et à l'analyse de composés chiraux, notamment dans le domaine pharmaceutique. Ce type de colonne peut être envisagé lorsque les colonnes classiques à phase inverse et à phase normale ne peuvent pas réaliser la séparation des isomères. Par exemple, l'auteur a utilisé une colonne chirale de 5 μm*4,6 mm*250 mm pour séparer les deux isomères de la 1,2-diphényléthylènediamine : (1S, 2S)-1, 2-diphényléthylènediamine et (1R, 2R)-1, 2 -diphényléthylènediamine, et la séparation entre les deux atteint environ 2,0. Cependant, les colonnes chirales sont plus chères que les autres types de colonnes, généralement 1W+/pièce. Si de telles colonnes sont nécessaires, l'unité doit disposer d'un budget suffisant. 3.5 Colonne échangeuse d'ions
Les colonnes échangeuses d'ions conviennent à la séparation et à l'analyse des ions chargés, tels que les ions, les protéines, les acides nucléiques et certaines substances sucrées. Selon le type de charge, elles sont divisées en colonnes échangeuses de cations, colonnes échangeuses d'anions et colonnes échangeuses de cations forts.
Les colonnes échangeuses de cations comprennent des colonnes à base de calcium et d'hydrogène, qui conviennent principalement à l'analyse de substances cationiques telles que les acides aminés. Par exemple, l’auteur a utilisé des colonnes à base de calcium pour analyser le gluconate de calcium et l’acétate de calcium dans une solution de rinçage. Les deux substances ont eu de fortes réponses à λ = 210 nm et le degré de séparation a atteint 3,0 ; l'auteur a utilisé des colonnes à base d'hydrogène pour analyser des substances liées au glucose. Plusieurs substances apparentées majeures – le maltose, le maltotriose et le fructose – présentaient une sensibilité élevée sous les détecteurs différentiels, avec une limite de détection aussi basse que 0,5 ppm et un degré de séparation de 2,0 à 2,5.
Les colonnes échangeuses d'anions conviennent principalement à l'analyse de substances anioniques telles que les acides organiques et les ions halogènes ; les colonnes échangeuses de cations fortes ont une capacité d'échange d'ions et une sélectivité plus élevées et conviennent à la séparation et à l'analyse d'échantillons complexes.
Ce qui précède n'est qu'une introduction aux types et aux domaines d'application de plusieurs colonnes de chromatographie liquide courantes, combinées à la propre expérience de l'auteur. Il existe d'autres types spéciaux de colonnes chromatographiques dans des applications réelles, telles que les colonnes chromatographiques à grands pores, les colonnes chromatographiques à petits pores, les colonnes de chromatographie d'affinité, les colonnes de chromatographie multimode, les colonnes de chromatographie liquide à ultra haute performance (UHPLC), les colonnes de chromatographie en fluide supercritique ( SFC), etc. Ils jouent un rôle important dans différents domaines. Le type spécifique de colonne chromatographique doit être sélectionné en fonction de la structure et des propriétés de l'échantillon, des exigences de séparation et d'autres objectifs.
Heure de publication : 14 juin 2024