La phase mobile est équivalente à la phase liquide du sang, et il y a diverses choses auxquelles il faut faire attention pendant l'utilisation. Parmi eux, il y a certains « pièges » auxquels il faut prêter attention.
01. Mesurer le pH de la phase mobile après ajout de solvant organique
Si vous mesurez le pH avec un additif organique, le pH que vous obtiendrez sera différent de celui avant l’ajout du solvant organique. Mais le plus important est d’être cohérent. Si vous mesurez toujours le pH après avoir ajouté le solvant organique, assurez-vous d'indiquer les étapes de la méthode que vous utilisez afin que d'autres suivent la même méthode. Cette méthode n’est pas précise à 100 %, mais elle permettra au moins de maintenir la cohérence de la méthode. Cela peut être plus important que d’obtenir une valeur précise du pH.
02. Aucun tampon utilisé
Le but d’un tampon est de contrôler le pH et d’éviter qu’il ne change. De nombreuses autres méthodes modifient le pH de la phase mobile, ce qui peut entraîner des modifications du temps de rétention, de la forme et de la réponse du pic.
L'acide formique, le TFA, etc. ne sont pas des tampons
03. Ne pas utiliser de tampon dans la plage de pH normale
Chaque tampon a une largeur de plage de 2 unités pH, dans laquelle il offre la meilleure stabilité du pH. Les tampons en dehors de cette fenêtre n’offriront pas de résistance efficace aux changements de pH. Utilisez un tampon dans la plage appropriée ou choisissez un tampon qui couvre la plage de pH dont vous avez besoin.
04. Ajouter du tampon à la solution organique
Le mélange d’une solution tampon avec une phase organique entraînera très probablement la précipitation du tampon. Dans de nombreux cas, même si des précipitations ont eu lieu, elles restent difficiles à détecter. N'oubliez pas de toujours ajouter la solution organique à la phase aqueuse, ce qui peut réduire considérablement le risque de précipitation du tampon.
05. Mélanger le gradient de concentration à partir de 0% avec une pompe
Les pompes disponibles aujourd'hui peuvent mélanger efficacement les phases mobiles et dégazer en ligne, mais tous ceux qui utilisent votre méthode ne disposeront pas d'une pompe de haute qualité. Mélangez A et B en une seule solution et exécutez-la à 100 % en ligne.
Par exemple, 950 ml de mélange organique de départ peuvent être préparés en mélangeant avec 50 ml d'eau. L’avantage est que cela peut réduire la variabilité entre les HPLC et réduire le risque de bulles et de précipitations dans le système. Il convient de noter que le rapport du mélange à pompe est de 95:5, ce qui ne signifie pas que le temps de séjour du pré-mélange dans la bouteille est également de 95:5.
06. Ne pas utiliser le bon acide (base) modifié pour changer le tampon
Utilisez uniquement l'acide ou la base qui forme le sel tampon que vous utilisez. Par exemple, un tampon phosphate de sodium doit être préparé avec uniquement de l'acide phosphorique ou de l'hydroxyde de sodium.
07. Ne pas indiquer toutes les informations sur le tampon dans la méthode, comme l'ajout de 5 g dephosphate de sodium pour 1000 ml d'eau.
Le type de tampon détermine la plage de pH qui peut être tamponnée. La concentration requise détermine la force du tampon. 5 grammes de phosphate de sodium anhydre et 5 grammes de phosphate monosodique monohydraté ont des forces tampons différentes.
08. Ajout de solvants organiques avant de vérifier
Si la méthode précédente utilisait une solution tampon pour la ligne de base B et que votre méthode utilise une solution organique pour la ligne de base B, vous pourrez, espérons-le, déposer le tampon dans le tube de la pompe et la tête de pompe.
09. Soulevez la bouteille et videz la dernière goutte
Il y a de fortes chances que vous ne disposiez pas de suffisamment de phase mobile pour terminer l’analyse complète et que votre échantillon fume. Outre la possibilité de brûler le système de pompe et la colonne, la phase mobile s'évaporera complètement et la phase mobile au sommet de la bouteille changera.
10. Utiliser la phase mobile de dégazage par ultrasons
Le point le plus important est de s’assurer que tous les sels tampons sont dissous, mais c’est la pire façon de dégazer et cela réchauffera rapidement la phase mobile, provoquant l’évaporation des composants organiques. Pour éviter des ennuis inutiles plus tard, prenez cinq minutes pour filtrer sous vide votre phase mobile.
Heure de publication : 27 août 2024