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Principes et méthodes d'analyse quantitative par chromatographie liquide

Principes et méthodes d'analyse quantitative par chromatographie liquide

 

Le mécanisme de séparation de la chromatographie liquide repose sur la différence d’affinité des composants du mélange pour les deux phases.

Selon les différentes phases stationnaires, la chromatographie liquide est divisée en chromatographie liquide-solide, chromatographie liquide-liquide et chromatographie en phase liée.Les plus largement utilisées sont la chromatographie liquide-solide avec du gel de silice comme charge et la chromatographie en phase greffée avec de la microsilice comme matrice.

Selon la forme de phase stationnaire, la chromatographie liquide peut être divisée en chromatographie sur colonne, chromatographie sur papier et chromatographie sur couche mince.Selon la capacité d'adsorption, elle peut être divisée en chromatographie d'adsorption, chromatographie de partage, chromatographie d'échange d'ions et chromatographie de perméation de gel.

Ces dernières années, un système d'écoulement de liquide à haute pression a été ajouté au système de chromatographie sur colonne liquide pour permettre à la phase mobile de s'écouler rapidement sous haute pression afin d'améliorer l'effet de séparation, donc une chromatographie liquide à haute efficacité (également connue sous le nom de haute pression). a émergé.

PARTIE
01 Principe d'analyse quantitative de la chromatographie liquide

Pour quantifier sur la base de substances qualitatives, des substances pures sont nécessaires comme étalons ;

La quantification par chromatographie liquide est une méthode relativement quantitative : c'est-à-dire que la quantité d'analyte dans le mélange est estimée à partir d'une quantité connue d'échantillon standard pur.

PARTIE
02 Base de quantification par chromatographie liquide

La quantité du composant mesuré (W) est proportionnelle à la valeur de réponse (A) (hauteur du pic ou surface du pic), W = f × A.

Facteur de correction quantitative (f) : il s'agit de la constante de proportionnalité de la formule de calcul quantitatif et sa signification physique est la quantité de composant mesuré représentée par la valeur de réponse unitaire (surface de pic).

Le facteur de correction quantitatif peut être obtenu à partir de la quantité connue d'échantillon standard et de sa valeur de réponse.

Mesurez la valeur de réponse du composant inconnu, et la quantité du composant peut être obtenue par le facteur de correction quantitatif.

PARTIE
03 Termes courants en analyse quantitative

Échantillon (échantillon) : une solution contenant un analyte pour analyse chromatographique.Divisé en échantillons standards et inconnus.

Standard : Un produit pur avec une concentration connue.Échantillon inconnu (inconnu) : Le mélange dont la concentration doit être testée.

Poids de l'échantillon : la pesée originale de l'échantillon à tester.

Dilution : le facteur de dilution de l'échantillon inconnu.

Composant : le pic chromatographique à analyser quantitativement, c'est-à-dire l'analyte dont la teneur est inconnue.

Quantité de composant (quantité) : la teneur (ou la concentration) de la substance à tester.

Intégrité : Processus informatique de mesure de l'aire d'un pic chromatographique par un ordinateur.

Courbe d'étalonnage : courbe linéaire du contenu du composant par rapport à la valeur de réponse, établie à partir d'une quantité connue de substance standard, utilisée pour déterminer le contenu inconnu de l'analyte.

1668066359515 Article 4

PARTIE
04 Analyse quantitative de la chromatographie liquide

1. Sélectionnez une méthode chromatographique adaptée à l'analyse quantitative :

l Confirmer le pic du composant détecté et atteindre une résolution (R) supérieure à 1,5

l Déterminer la consistance (pureté) des pics chromatographiques des composants testés

l Déterminer la limite de détection et la limite de quantification de la méthode ;sensibilité et plage linéaire

2. Établir une courbe d'étalonnage avec des échantillons étalons de différentes concentrations

3. Vérifier l'exactitude et la précision des méthodes quantitatives

4. Utilisez le logiciel de gestion de chromatographie correspondant pour mettre en œuvre la collecte d'échantillons, le traitement des données et le rapport des résultats

PARTIE
05 Identification des pics quantitatifs (qualitatifs)

Identifier qualitativement chaque pic chromatographique à quantifier

Tout d’abord, utilisez l’échantillon standard pour déterminer le temps de rétention (Rt) du pic chromatographique à quantifier.En comparant le temps de rétention, trouvez le composant correspondant à chaque pic chromatographique dans l’échantillon inconnu.La méthode qualitative chromatographique consiste à comparer le temps de rétention avec l'échantillon standard.Le critère Insuffisantconfirmation supplémentaire (qualitative)

1. Méthode d'addition d'étalons

2. Utiliser d'autres méthodes en même temps : d'autres méthodes chromatographiques (changer le mécanisme, telles que : utiliser différentes colonnes chromatographiques), d'autres détecteurs (PDA : comparaison de spectres, recherche de bibliothèque de spectres ; MS : analyse de spectre de masse, recherche de bibliothèque de spectres)

3. Autres instruments et méthodes

PARTIE
06 Confirmation de la cohérence quantitative des pics

Confirmer la cohérence du pic chromatographique (pureté)

Assurez-vous qu’il n’y a qu’un seul composant mesuré sous chaque pic chromatographique

Vérifier l'interférence des substances co-éluées (impuretés)

Méthodes de confirmation de la consistance des pics chromatographiques (pureté)

Comparaison de spectrogrammes avec des détecteurs à matrice de photodiodes (PDA)

Identification de la pureté maximale

2996 Théorie de l'angle de pureté

Méthodes quantitatives couramment utilisées dans la PARTIE 07

Méthode de courbe standard, divisée en méthode standard externe et méthode standard interne :

1. Méthode standard externe: le plus utilisé en chromatographie liquide

Une série d'échantillons standards de concentrations connues ont été préparées en utilisant des échantillons purs des composés à tester comme échantillons standards.injecté dans la colonne jusqu'à sa valeur de réponse (surface de pic).
Dans une certaine plage, il existe une bonne relation linéaire entre la concentration de l'échantillon standard et la valeur de réponse, à savoir W= f×A , et une courbe standard est établie.

Dans exactement les mêmes conditions expérimentales, injectez l'échantillon inconnu pour obtenir la valeur de réponse du composant à mesurer.Selon le coefficient f connu, la concentration du composant à mesurer peut être obtenue.

Les avantages de la méthode des étalons externes :opération et calcul simples, c’est une méthode quantitative couramment utilisée ;il n'est pas nécessaire de détecter et d'éluer chaque composant ;un échantillon standard est requis ;les conditions de mesure de l'échantillon standard et de l'échantillon inconnu doivent être cohérentes ;le volume d'injection doit être précis.

Inconvénients de la méthode des étalons externes :Les conditions expérimentales doivent être élevées, telles que la sensibilité du détecteur, le débit et la composition de la phase mobile ne peuvent pas être modifiés ;le volume de chaque injection doit avoir une bonne répétabilité.

2. Méthode standard interne: précis, mais gênant, le plus utilisé dans les méthodes standards

Une quantité connue de l'étalon interne est ajoutée à l'étalon pour obtenir un étalon mixte, et une série d'étalons de travail de concentration connue est préparée.Le rapport molaire de l'étalon à l'étalon interne dans l'étalon mixte reste inchangé.Injectez dans la colonne chromatographique et prenez (surface de pic d'échantillon standard/surface de pic d'échantillon standard interne) comme valeur de réponse.Selon la relation linéaire entre la valeur de réponse et la concentration de l'étalon de travail, à savoir W= f×A , une courbe standard est établie.

Une quantité connue d'étalon interne est ajoutée à l'échantillon inconnu et injectée dans la colonne pour obtenir la valeur de réponse du composant à mesurer.Selon le coefficient f connu, la concentration du composant à mesurer peut être obtenue.

Les caractéristiques de la méthode étalon interne :Pendant l'opération, l'échantillon et l'étalon interne sont mélangés et injectés dans la colonne chromatographique, de sorte que tant que le rapport entre la quantité du composant mesuré et l'étalon interne dans la solution mélangée est constant, le changement du volume de l'échantillon n’affectera pas les résultats quantitatifs..La méthode standard interne compense l'influence du volume de l'échantillon, et même de la phase mobile et du détecteur, elle est donc plus précise que la méthode standard externe.

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08 Facteurs affectant les résultats de l'analyse quantitative

Une mauvaise précision peut être causée par :

Intégration incorrecte de la zone de pic, décomposition de l'échantillon ou impuretés introduites lors de la préparation de l'échantillon, flacon d'échantillon non scellé, volatilisation de l'échantillon ou du solvant, préparation incorrecte de l'échantillon, problèmes d'injection de l'échantillon, préparation incorrecte de l'étalon interne

Raisons possibles d'une mauvaise précision :

Intégration incorrecte des pics, problèmes d'injection ou d'injecteur, décomposition de l'échantillon ou impuretés introduites lors de la préparation de l'échantillon, problèmes chromatographiques, réponse dégradée du détecteur

 


Heure de publication : 10 novembre 2022